Tips

細胞調製

  1. 細胞濃度

     通常の細胞は1〜3×107 cells/ml 程度に調製してください。
     サイズの大きい細胞(癌細胞等セルライン、付着系細胞、iPS細胞等)は、
     5×106 cells/ml程度に調製してください。
     場合により希釈する場合もありますので、medium等を余分にお持ちください。


  2. Filtration

     ソーティング、解析の前にサンプルを40-50μmナイロンメッシュフィルターに
     必ず通してください。これはノズルの詰まりを避けるためです。
     付着性の高い細胞の場合、sorting中に再度フィルターをかけることがあります。


  3. 回収容器の準備

     ソートする細胞を回収する容器をご準備ください。
     得られる細胞数、あるいはソート後の細胞で何を行うかによりますが、1.5ml E.tube、
     5ml FALCON Tube、15ml コニカルチューブ、6〜384well plate などを使用します。
     チューブはポリプロピレン素材の方が、回収細胞の壁への付着が低く、回収率が向上します。
     また、FCSやFBSのような血清によるコーティングも付着を抑えます。
     回収容器には予めメディウム等を容器の1/2〜1/3程度加えてください。


  4. 細胞回収にかかる時間

     上記の細胞濃度でサンプルを調製した場合、1秒間に5,000〜25,000 cells、
     1時間で1.8×107〜5.4×107 cellsを処理することが可能です(細胞種によって異なります)。
     純度はどの速度でもほぼ変わりませんが(98%以上)、回収率は高速になるにしたがい低下します。
     持ち込まれた細胞数、目的細胞の回収希望数などで処理速度を決めています。


  5. 低頻度の細胞

     頻度の極めて低い細胞のソーティングやマルチカラー解析などを行う際には、磁気ビーズ法による
     pre-depletionや抗体と蛍光色素のパネル選択など、事前検討が重要です。
     スタッフにご相談ください。



蛍光色素

  発現レベルの弱い分子には、明るい蛍光色素標識のものを使用してください。

  Relative Brightness
Laser  Very Bright Bright    Moderate Dim    
UV
355nm
BUV737

BUV395


 
Violet
405nm
BV421
BV650
BV711
BV605
BV786
BV510 V450
V500
Blue
488nm
BB515
PE-CF594 
PE-Cy5
PE
PE-Cy7
FITC
Alexa488
PerCP-Cy5.5
PerCP
Red
640nm
 
  APC
Alexa647
  Alexa700
APC-H7
APC-Cy7
BUV : Brilliant Ultraviolet
BV : Brilliant Violet
BB : Brilliant Blue
Alexa : Alexa Fluor

出展:Becton, Dickinson and Company(一部改変)